Protokoll: Maleimid-Markierung von Proteinen und anderen thiolhaltigen Biomolekülen

Die Reaktion von Thiolen mit Maleimiden wird weitverbreitet für die Biokonjugation und Markierung von Biomolekülen (einschließlich Proteinen und Peptiden) genutzt. Sie läuft nach folgendem Schema ab:

Thiol maleimide reaction scheme

Maleimide sind elektrophile Substanzen, die eine hohe Selektivität für Thiole aufweisen. Während Maleimide fast nirgends in der Natur vorkommen, sind Thiole weit verbreitet. In Proteinen und Peptiden findet man sie als Cysteinreste. Wenngleich natürliche DNA keine Thiolgruppen enthält, können synthetische Oligonukleotide mit Thiolgruppen einfach hergestellt werden.

Thiole sind anfällig für oxidative Dimerisierung in Form der Ausbildung von Disulfidbindungen. So bilden beispielsweise Cysteinreste Cystinbrücken aus, die die Tertiärstruktur von Proteinen stabilisieren. Solche Disulfide reagieren nicht mit Maleimiden. Daher ist es notwendig, Disulfidbrücken vor der Konjugation zu reduzieren und Sauerstoff aus der Reaktion auszuschließen.

Das Konjugationsprotokoll ist abhängig von der Löslichkeit der Ausgangskomponenten. Bei Reagenzien mit geringer Wasserlöslichkeit (wie z. B. den meisten Fluorophor-Maleimiden) ist der Einsatz eines organischen Hilfslösungsmittels, wie beispielsweise DMSO oder DMF, unverzichtbar.

Wir empfehlen folgendes Protokoll für die Konjugation von Farbstoff-Maleimiden von Lumiprobe mit Proteinen, Peptiden und anderen thiolhaltigen Biomolekülen:

  1. Lösen Sie die zu markierende Substanz in entgastem Puffer bei pH 7−7,5 (PBS, TRIS, HEPES sind gut geeignet, wobei auch andere Puffer verwendet werden können, die keine Thiole enthalten) in einem Reaktionsgefäß. Der Puffer kann entgast werden, indem man für mehrere Minuten ein Vakuum anlegt oder Inertgas (Stickstoff, Argon oder Helium) hindurchperlen lässt. Eine geeignete Proteinkonzentration liegt im Bereich von 1−10 mg/ml.
  2. Geben Sie einen 100-fachen molaren Überschuss an TCEP (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin) hinzu, um Disulfidbindungen zu reduzieren. Verdrängen Sie anschließend die Luft im Reaktionsgefäß durch Inertgas und schließen Sie es. Inkubieren Sie die Lösung 20 min lang bei Raumtemperatur.
  3. Lösen Sie das Maleimid in DMSO oder in frischem DMF (1−10 mg in 100 µl).1
  4. Geben Sie die Fluorophor-Lösung zur Thiol-Lösung (20-facher Überschuss an Fluorophor). Verdrängen Sie anschließend die Luft im Reaktionsgefäß durch Inertgas und schließen Sie es.
  5. Mischen Sie sorgfältig und inkubieren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur oder 4 °C.
  6. Reinigen Sie das Reaktionsprodukt mittels Gelfiltration, HPLC, FPLC oder Elektrophorese.2

1 Für Maleimide mit geringer Wasserlöslichkeit, was für die meisten Maleimide zutrifft, empfehlen wir die Verwendung eines Hilfslösungsmittels (DMF oder DMSO). Gut wasserlösliche Maleimide (wie Sulfo-Cyanin-Maleimide) können direkt in Wasser gelöst werden. Sollte ein Präzipitat entstehen, erhöhen Sie den Anteil des organischen Hilfslösungsmittels, um eine bessere Markierung zu erzielen.

2 Dialyse ist als Reinigunsmethode nur bei gut wasserlöslichen Maleimiden zu empfehlen.

Related products

BDP-FL-maleimid

BDP-FL-maleimid ist ein heller und photostabiler Thiol-reaktiver Fluoreszenzfarbstoff für die Protein-Markierung, eine ideale Alternative für Fluorescein in der Mikroskopie.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
11480 1 mg $110.00 Auf Lager
21480 5 mg $210.00 Auf Lager
41480 25 mg $410.00 Auf Lager
51480 50 mg $695.00 5 Tage
61480 100 mg $1190.00 5 Tage

BDP-R6G-maleimid

BDP R6G ist ein Bordipyrromethen-Fluorophor, der auf Filtersätze für Rhodamin 6G (R6G) abgestimmt ist. Es handelt sich hier um ein thiolreaktives Maleimid insbesondere für die Markierung von Cysteinresten in Proteinen.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
14480 1 mg $110.00 Auf Lager
24480 5 mg $210.00 Auf Lager
44480 25 mg $410.00 Auf Lager
54480 50 mg $695.00 Auf Lager
64480 100 mg $1190.00 Auf Lager

Cyanin-3-maleimid

Cyanin-3-maleimid ist ein Thiol-reaktiver Fluoreszenzfarbstoff.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
11080 1 mg $110.00 Auf Lager
21080 5 mg $210.00 Auf Lager
41080 25 mg $410.00 Auf Lager
51080 50 mg $695.00 Auf Lager
61080 100 mg $1190.00 Auf Lager

Cyanin-5-maleimid

Cyanin-5-maleimid reagiert mit Thiolen und ergibt fluoreszenzmarkierte Konjugate.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
13080 1 mg $110.00 Auf Lager
23080 5 mg $210.00 Auf Lager
43080 25 mg $410.00 Auf Lager
53080 50 mg $695.00 Auf Lager
63080 100 mg $1190.00 Auf Lager

Cyanin-5.5-maleimid

Cyanin-5.5-maleimid ist ein thiolreaktiver Fluoreszenzfarbstoff für die Proteinmarkierung.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
17080 1 mg $110.00 Auf Lager
27080 5 mg $210.00 5 Tage
47080 25 mg $410.00 Auf Lager
57080 50 mg $695.00 Auf Lager
67080 100 mg $1190.00 Auf Lager

Cyanin-7-maleimid

Cyanin-7-maleimid ist ein sulfhydryl-reaktiver NIR-Farbstoff.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
15080 1 mg $110.00 Auf Lager
25080 5 mg $210.00 Auf Lager
45080 25 mg $410.00 Auf Lager
55080 50 mg $695.00 Auf Lager
65080 100 mg $1190.00 Auf Lager

Cyanin-7.5-maleimid

Cyanin-7.5-maleimid ist ein thiolreaktiver NIR-Farbstoff.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
16080 1 mg $110.00 Auf Lager
26080 5 mg $210.00 Auf Lager
46080 25 mg $410.00 Auf Lager
56080 50 mg $695.00 Auf Lager
66080 100 mg $1190.00 Auf Lager

FAM-maleimid, 6-Isomer

Fluorescein(FAM)-maleimid ist ein thiolreaktives Derivat des isomerenreinen 6-FAM. Fluorescein ist ein heller Fluoreszenzfarbstoff, der mit einer Vielzahl von Messgeräten kompatibel ist.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
44180 25 mg $160.00 5 Tage
54180 50 mg $270.00 Auf Lager
64180 100 mg $420.00 Auf Lager

Pyrenmaleimid

Maleimidderivat von Pyren für die Markierung von Thiolgruppen. Pyren ist eine Excimer-bildende Sonde zur Untersuchung der molekularen Umgebung.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
13580 1 mg $110.00 Auf Lager
23580 5 mg $210.00 Auf Lager
43580 25 mg $410.00 Auf Lager
53580 50 mg $695.00 Auf Lager
63580 100 mg $1190.00 Auf Lager

Sulfo-Cyanin-3-maleimid

Waserlösliches Thiol-reaktives Derivat von Cyanin 3.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
11380 1 mg $110.00 Auf Lager
21380 5 mg $290.00 Auf Lager
41380 25 mg $690.00 Auf Lager
51380 50 mg $1270.00 Auf Lager
61380 100 mg $1990.00 Auf Lager

Sulfo-Cyanin-5-maleimid

Thiol-reaktiver, wasserlöslicher Cyanin-Fluorophor zur Kopplung an Thiole
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
13380 1 mg $110.00 Auf Lager
23380 5 mg $290.00 Auf Lager
43380 25 mg $690.00 5 Tage
53380 50 mg $1270.00 Auf Lager
63380 100 mg $1990.00 Auf Lager

Sulfo-Cyanin-5.5-maleimid

Sulfo-Cyanin 5.5 ist ein wasserlöslicher Fluorophor, der im fernroten Bereich des Spektrums emittiert. Dieses Thiol-reaktive Maleimid empfiehlt sich für die Markierung empfindlicher Proteine.
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
17380 1 mg $110.00 Auf Lager
27380 5 mg $290.00 Auf Lager
47380 25 mg $690.00 Auf Lager
57380 50 mg $1270.00 Auf Lager
67380 100 mg $1990.00 Auf Lager

Sulfo-Cyanin-7-maleimid

Wasserlösliches Nahinfrarot-Maleimid für die Markierung von Proteinen und Peptiden
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
15380 1 mg $110.00 Auf Lager
25380 5 mg $290.00 Auf Lager
45380 25 mg $690.00 Auf Lager
55380 50 mg $1270.00 Auf Lager
65380 100 mg $1990.00 Auf Lager

Sie haben den Artikel in den Warenkorb gelegt.. Warenkorb ansehen oder zur Kasse gehen
Die eingegebene Zahl ist falsch..