Messung der Zellproliferation und DNA-Replikation mittels Click-Chemie

Zellproliferationsmessungen spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Zytotoxizität, in der Krebsforschung und vielen anderen Bereichen der Zellbiologie. Dazu wurden eine Reihe von Methoden entwickelt, die auch isotopenbasierte Techniken einschließen. Die meisten Methoden, die auf optischen Nachweisverfahren beruhen, wie z. B. Fluoreszenzdetektion, sind auch für Hochdurchsatzverfahren geeignet.

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Der Nachweis replizierter DNA stellt wohl den direktesten Weg dar, um Proliferation zu messen. Das wird z. B. durch den Einsatz von Bromodesoxyuridin (BrdU) erreicht, das während der Replikation in die DNA eingebaut wird. Anschließend können diese exogenen Nukleoside mit Hilfe von anti-BrdU-Antikörpern in der DNA nachgewiesen werden. Dieses Nachweisverfahren ist mühsam und schwierig zu reproduzieren, weil die Zellen mit harschen Reagenzien behandelt werden müssen, damit die DNA für die Antikörper zugänglich wird, die die zellulären Strukturen andernfalls nicht durchdringen könnten.

Eine sanftere Alternative bietet der Einsatz des Nukleosids Ethinyldesoxyuridin (EdU), das durch Fütterung oder Injektion appliziert wird. Nachdem das Nukleosid in die DNA eingebaut wurde, kann es mit verschiedenen Fluorophor-Aziden mittels Kupfer(I)-Katalyse konjugiert werden, wodurch die replizierte DNA mit dem Fluoreszenzmarker angefärbt wird. Das Verfahren ist leicht durchzuführen, schnell und reproduzierbar. Es bedarf keiner so harschen Behandlung der Zellen (lediglich die Permeabilisierung mit Triton ist erforderlich), wodurch zelluläre Strukturen besser erhalten bleiben. Die Vorgehensweise ist mit einer Zellfixierung vergleichbar und erlaubt Mehrfarben-Imaging.

Benötigte Reagenzien:

EdU – Ethinyldesoxyuridin
Kupfer(II)-BTTAA-Komplex – Katalysator für die Click-Chemie
Ascorbinsäure – Reduktionsmittel für Kupfer
Fluorophor-Azide
DMSO, Markierungsgüte – Lösungsmittel für Azide
Triton X-100 oder Tween-20
PBS, pH 7,4
100 mM Tris-Puffer, pH 7,4

Protokoll

Die Details der Durchführung hängen vom jeweiligen Zell- oder Gewebetyp ab. Im Folgenden stellen wir Ihnen die grundsätzlichen Schritte vor:

Zellen bzw. Gewebe mit EdU kultivieren.
Zellen mit PBS waschen.
Zellen permeabilisieren mit PBS + 0,2 % Triton X-100 oder 0,5 % Tween-20 für 30 min.
Zellen erneut mit PBS waschen.
Entwicklerlösung frisch herstellen: 2 mM Kupfer(II)-BTTAA-Komplex, 5 μM Fluorophor-Azid und 10 mM Ascorbinsäure in 100 mM Tris-Puffer pH 7,4 (für sulfonierte Azide) oder 100 mM Tris-Puffer mit 50 % DMSO (für nicht-sulfonierte Azide). Diese Lösung sollte frisch hergestellt werden, weil Kupfer(I)- und Ascorbinsäurelösungen nicht stabil sind.
Zellen 30 min in der Entwicklerlösung inkubieren.
Zellen mit PBS waschen.

Sulfonierte, wasserlösliche Azide wie Sulfo-Cyanin-3-azid und Sulfo-Cyanin-5-azid liefern die besten Ergebnisse. Beim Einsatz nicht-sulfonierter Azide wie Cyanin-5-azid, Cyanin-3-azid oder BDP-FL-azid muss die Entwicklerlösung 50 % DMSO enthalten. Bei Bedarf können die Zellen später mit Ethanol entfärbt werden.

Referenz

Ranall, M.; Gabrielli, B.; Gonda, T. Adaptation and validation of DNA synthesis detection by fluorescent dye derivatization for high-throughput screening. BioTechniques, 2010, 48(5), 379-386. doi: 10.2144/000113410

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