Oligonukleotid-Markierung auf Basis der Click-Chemie
Gegenwärtig werden markierte und doppeltmarkierte Oligonukleotidsonden vorwiegend unter Verwendung farbstoffmarkierter Amidite oder aktivierter Ester hergestellt. Beide Methoden haben ihre Grenzen.
Unternehmen und Einrichtungen, die im Bereich der kundenspezifischen Oligonukleotidsynthese tätig sind, bieten wir eine Lösung für die Oligomarkierung auf Basis der Click-Chemie.
Genau wie im Fall der NHS-Ester handelt es sich bei der Click-Chemie-Markierung um ein zweistufiges Verfahren. Zuerst wird unter Verwendung eines Alkinamidits ein Alkinrest in das Oligonukleotid eingebaut. Anschließend wird das entschützte Oligonukleotid unter geeigneten Bedingungen mit einem Farbstoffazid markiert. Das markierte Oligonukleotid wird danach mit Aceton ausgefällt und gereinigt (HPLC ist die dafür am besten geeignete Methode).
Im Vergleich zur Phosphoramidit-Methode liefert die Click-Chemie-Markierung sauberere Sonden bei höheren Ausbeuten und die Reinigung der Sonden ist weniger aufwändig. Der empfindliche und kostenintensive Farbstoff kommt nicht mit den reaktiven Deblockierungsreagenzien in Kontakt und wird nicht vergeudet. Es besteht keine Notwendigkeit, besonders milde Schutzgruppen zu verwenden.
Im Vergleich zur Methode mit aktivierten Estern ist die Click-Chemie-Reaktion besser skalierbar und erfordert weniger Farbstoff. Die Sonden sind einfacher zu reinigen. Der Überschuss des Farbstoffes wird während der Acetonfällung fast vollständig abgetrennt. Bei der Markierung mit aktivierten Estern das oft nicht der Fall, wo mitunter mehrere Fällungen erforderlich sind, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Die Click-Chemie ermöglicht die Markierung hunderter OD260-Einheiten eines Oligonukleotids in einem einzigen Reaktionsansatz.
Die Wirtschaftlichkeit dieser Markierungsmethode ist verrgleichbar mit der Amiditmarkierung und der NHS-Ester-Markierung.
| Phosphoramidit | NHS-Ester | Click-Chemie | |
|---|---|---|---|
| Empfindlicher Farbstoff ist Deblockierungsbedingungen ausgesetzt |
ja | nein | nein |
| Skalierbarkeit | gut | begrenzt | hervorragend |
| Reinheit des ungereinigten Markierungsgemisches | 30–90 % | 60–95 % | ≥95 % |
| Überschuss des für die Markierung verwendeten Farbstoffes | 10 Moläquivalente | 10 Moläquivalente | 1,2–1,5 Moläquivalente |
| Vollständigkeit der Markierung | ≥98 % | 60–100 % | 99–100 % |
| Merkmale | - einfaches Protokoll - geringe Oligoausbeute - schwierig zu reinigen - geringe Stabilität der Amidite |
- hochrein - großer Farbstoffüberschuss - unvollständige Markierung |
- hochrein - hohe Effizienz - geringer Farbstoffüberschuss - kompetitiver Preis |
Wir bieten alle für die Oligomarkierung erforderlichen Reagenzien an: Alkinamidite (5'-terminal und Dmt-geschützt für die 3'-Markierung an universellem CPG), Alkin-CPG, Farbstoffazide und einen Click-Chemie-Katalysator. Verwenden Sie unser empfohlenes Protokoll für die Markierung von Oligonukleotiden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
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