Protokoll: Click-Chemie-Markierung von Oligonukleotiden und DNA

Click-Chemie ist eine vielseitige Reaktion, die für die Synthese einer Vielzahl von Konjugaten verwendet werden kann. Praktisch beliebige Biomoleküle können beteiligt sein, und die Markierung mit kleinen Molekülen, wie zum Beispiel Fluoreszenzfarbstoffen, Biotin und anderen Gruppen kann mühelos erzielt werden.

Die Click-Chemie-Reaktion läuft zwischen zwei Komponenten ab: Azid and Alkin (endständiges Acetylen). Sowohl Azidogruppen als auch Alkingruppen liegen fast nie in natürlichen Biomolekülen vor. Demzufolge ist die Reaktion stark bioorthogonal und sehr spezifisch. Wenn die Notwendigkeit besteht, ein Oligonukleotid zu markieren, können alkinmodifizierte Oligonukleotide kundenspezifisch von zahlreichen Oligosyntheseeinrichtungen und Firmen geordert werden.

Protokoll

Wir empfehlen die Anwendung des folgenden allgemeinen Protokolls für die Click-Chemie-Markierung von alkinmodifizierten Oligonukleotiden mit von Lumiprobe hergestellten Aziden. Die Hilfsreagenzien können ebenfalls bei Lumiprobe bestellt werden.

  1. Berechnen Sie die Volumina der für die Click-Chemie-Markierung benötigten Reagenzien unter Verwendung der untenstehenden Tabelle. Bereiten Sie zudem die benötigten Stammlösungen vor (siehe Anhang).
    ReagenzEndkonzentrationKonzentration der Stammlösung
    Oligonukleotid, Alkin-modifiziert variabel (20−200 µM) variabel
    Azid 1,5-Faches der Oligonukleotid-konzentration 10 mM in DMSO
    DMSO 50 % (v/v)
    Ascorbinsäure 0,5 mM 5 mM in Wasser
    Cu-TBTA-Komplex 0,5 mM 10 mM in 55 % (v/v) DMSO
  2. Lösen Sie das alkinmodifizierte Oligonukleotid bzw. die DNA in einem druckfesten Glasfläschchen in Wasser auf.
  3. Geben Sie 2 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7,0 zu, um eine Endkonzentration von 0,2 M zu erreichen.
  4. Geben Sie DMSO zu und schütteln Sie.
  5. Geben Sie die Azid-Stammlösung (10 mM in DMSO) zu und schütteln Sie.
  6. Geben Sie das erforderliche Volumen der 5 mM Ascorbinsäure-Stammlösung hinzu und schütteln Sie kurz.
  7. Entgasen Sie die Lösung, indem Sie 30 Sekunden lang ein Inertgas hindurch leiten. Stickstoff, Argon oder Helium können für diesen Zweck verwendet werden.
  8. Geben Sie das erforderliche Volumen der 10 mM Kupfer(II)-TBTA-Stammlösung in 55 %-igem DMSO zu. Verdrängen Sie die Luft im Glasfläschchen mit Inertgas und verschließen Sie es mit einem Stopfen.
  9. Schütteln Sie die Lösung gründlich. Sollten Sie eine signifikante Ausfällung von Azid beobachten, erwärmen Sie das Glasfläschchen drei Minuten lang bei 80 °C und schütteln Sie es.
  10. Bewahren Sie die Reaktionslösung über Nacht bei Raumtemperatur auf.
  11. Fällen Sie das Konjugat mit Aceton (bei Oligonukleotiden) bzw. mit Ethanol (bei DNA) aus. Geben Sie mindestens das vierfache Volumen an Aceton zu der Lösung hinzu (bei einem großen Volumen an Reaktionslösung teilen Sie diese auf mehrere Glasfläschchen auf). Mischen Sie gründlich und inkubieren Sie das Gemisch 20 min lang bei −20 °C.
  12. Zentrifugieren Sie zehn Minuten lang bei 10.000 U/min.
  13. Verwerfen Sie den Flüssigkeitsüberstand.
  14. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml Aceton und zentrifugieren Sie zehn Minuten lang bei 10.000 U/min.
  15. Verwerfen Sie den Flüssigkeitsüberstand, trocknen Sie das Pellet und reinigen Sie das Konjugat mittels RP-HPLC oder PAGE.

Anhang. Zubereitung von Stammlösungen und Reagenzien für die Click-Chemie-Markierung

5 mM Ascorbinsäure-Stammlösung

Zubereitung Lösen Sie 18 mg Ascorbinsäure in 20 ml destilliertem Wasser auf.
Aufbewahrung Ascorbinsäure ist anfällig für Oxidation durch Luftsauerstoff. Die Lösung ist einen Tag lang stabil. Verwenden Sie jeweils frisch zubereitete Lösungen.

10 mM Kupfer(II)-TBTA-Stammlösung in 55 %-igem DMSO

Zubereitung Lösen Sie 25 mg Kupfer(II)-Sulfatpentahydrat in 10 ml destilliertem Wasser auf. Lösen Sie 58 mg TBTA-Ligand in 11 ml DMSO auf. Mischen Sie beide Lösungen.
Aufbewahrung Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur auf. Die Lösung ist über Jahre hinweg stabil.

2 M Triethylammoniumacetatpuffer pH 7,0

Zubereitung Mischen Sie 2,78 ml Triethylamin mit 1,14 ml Essigsäure. Füllen Sie auf ein Volumen von 10 ml auf und stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein.
Aufbewahrung Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur auf. Die Lösung ist über Jahre hinweg stabil.

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NIR-Fluoreszenzfarbstoff für die Click-Chemie
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Reines Dimethylsulfoxid (DMSO), dessen Qualität auf Click- und andere Konjugationsreaktionen abgestimmt wurde.
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FAM(Fluorescein)-azid für die Click-Chemie, reines 5-Isomer
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FAM-Azid ist ein häufig verwendetes Fluoreszenzfarbstoff-Azid für die Click-Chemie
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Katalysator für die Konjugationsreaktion der Click-Chemie
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Fluoreszenzfarbstoff Phenylethinylpyren (ein polyaromatischer Kohlenwasserstoff) zum Einsatz in Click-Chemie-Reaktionen
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Perylenazid

Perylen ist ein äußerst heller und fotostabiler grüner Fluorophor.
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Reagenz für Fluoreszenzmarkierung mit dem polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoff Pyren mittels Click-Chemie
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Pyrenazid 2

Pyrenazid mit längerem Linker für die Click-Chemie
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Pyrenazid 3

Pyrenazid mit noch längerem Linker für die Click-Chemie
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Rhodamin 110 Farbstoff-Azid (5-Isomer) für die Click-Chemie. Die R110-Fluoreszenz ähnelt der von FAM.
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Rhodamin-110-azid für die Click-Chemie; reines 6-Isomer
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15230 100 uL, 10 mM/DMSO $160.00 21 Tage
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45230 1 mL, 10 mM/DMSO $595.00 21 Tage

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Rhodamin 6G ist ein Xanthenfarbstoff, der schon lange in der DNA-Sequenzierung und qPCR eingesetzt wird. Dieses Azidderivat dient der Fluoreszenzmarkierung von DNA oder anderen Molekülen in einer Click-Chemie-Reaktion.
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Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
14430 100 uL, 10 mM/DMSO $110.00 Auf Lager
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Azid des Fluoreszenzfarbstoffs ROX (auch bekannt als Rhodamin X oder Rhodamin 101) für die Markierung von Biomolekülen mittels Click-Chemie
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11230 100 uL, 10 mM/DMSO $110.00 Auf Lager
31230 500 uL, 10 mM/DMSO $210.00 Auf Lager
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D1230 25 mg $410.00 Auf Lager
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Ein wasserlösliches Fluorophor-Alkin für die kupferkatalysierte Click-Chemie. Sulfo-Cyanin 3 ist ein heller und photostabiler Fluoreszenzfarbstoff für den Cy3®-Kanal.
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Wasserlösliches Sulfo-Cyanin 3 Farbstoff-Azid für die Click-Chemie
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Sulfo-Cyanin-5-alkin

ein wasserlösliches Cyanin 5 Alkinderivat für die Click-Chemie
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Wasserlösliches Sulfo-Cyanin 5 Fluoreszenzfarbstoff-Azid für die Click-Chemie
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Alkinderivat von TAMRA, reines 5-Isomer für die kupferkatalysierte Click-Chemie
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