Diese Seite ist leider nicht in deutscher Sprache verfügbar. Dies ist die Übersetzung auf Russisch.

Набор для выделения геномной ДНК универсальный

Набор предназначен для быстрого (~ 30 минут) и высокоэффективного выделения тотальной ДНК (геномной, митохондриальной и вирусной) на спин-колонках из широкого спектра образцов: тканей растений и животных, буккального эпителия, цельной крови, лейкоцитов, культур клеток животных и грам-отрицательных бактерий. Полученная ДНК стабильна и подходит для проведения ПЦР, обработки эндонуклеазами рестрикции, Саузерн-блоттинга, подготовки образцов для секвенирования по методу Сэнгера и NGS-секвенирования.

Ориентировочные выходы геномной ДНК (длина 30–50 тыс. пар нуклеотидов, OD260/OD280 1.7–1.8):

  • Клетки грам-отрицательных бактерий (108): 5–10 мкг
  • Лист растения, хвоя: 3–5 мкг
  • Хвост мыши: 7–14 мкг
  • Почка мыши: 10–20 мкг
  • Сердце мыши: 7–14 мкг
  • Печень мыши: 10–15 мкг
  • Лейкоциты, выделенные из 1 мл крови: 4–5 мкг
  • Цельная кровь (100 мкл): 1–3 мкг
  • Соскоб буккального эпителия: 0.5–2 мкг
  • Клетки млекопитающих (1x106): 3–6 мкг

Bestandteile

Komponente Anzahl
11573
10 minipreps
21573
50 minipreps
H1850, Lyselösung AS / Lysis Solution AS, 6 mL 1
F5450, Sorptionslösung / Sorption Solution, 4 mL 1
H2450, Waschlösung A / Wash Solution A (mit GuHCl), 6 mL 1
11650, RNase A (10 mg/mL), 50 uL 1
K3150, Red Blood Cell Lysis Buffer 10x, 10 mL 1
1902-5g, Corundum (50 μm), 5 g 1
P1850, Lyselösung AS / Lysis Solution AS, 30 mL 1
M5450, Sorptionslösung / Sorption Solution, 20 mL 1
P2450, Waschlösung A / Wash Solution A (mit GuHCl), 30 mL 1
31650, RNase A (10 mg/mL), 150 uL 2
S3150, Red Blood Cell Lysis Buffer 10x, 50 mL 1
1902-25g, Corundum (50 μm), 25 g 1
Zentrifugationssäulchen zur DNA-Extraktion (für bis zu 20 µg) 10 50
Sammelgefäß für Zentrifugationssäulchen, 2 ml 30 150
Pistill für Mikrozentrifugenröhrchen (Polypropylen) 10 50
K2250, Waschlösung B / Wash Solution B (Konzentrat muss mit 96%igem Ethanol 5-fach verdünnt werden), 10.0 mL 1 1
D1350, Elutionspuffer / Elution Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.5), 1.5 mL 1 4
12850, Proteinase К (lyophilisiert), 6.0 mg 1 1
B3850, Proteinase-K-Verdünnungspuffer / Proteinase K Dilution Buffer, 600 uL 1 1

Bei 20°C lagern.

Haltbarkeit: 12 Monate

Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора:

  • Твердотельный термостат (возможно использование водяной бани)
  • Настольная центрифуга с ротором для 1.5 мл пробирок со скоростью вращения не менее 10000 об/мин (6700 x g)
  • Микроцентрифужные пробирки объемом 1.5 мл (2 пробирки для выделения ДНК из 1 образца)
  • 96 % этанол
  • Натрий-фосфатный буфер (PBS) для выделения ДНК из клеток млекопитающих и бактерий, лейкоцитов
  • Фарфоровая ступка для гомогенизации образца при выделении ДНК из тканей растений и животных (в случае если пестик-гомогенизатор не подходит для гомогенизации образца)

Перед началом работы

  1. Разбавьте концентрат промывочного раствора B в 5 раз 96 % этанолом (к указанному на банке объему концентрата добавьте 4 объема 96 % этанола), оставьте отметку о добавлении этанола на крышке.

  2. Добавьте 600 мкл буфера для растворения протеиназы К в пробирку с лиофилизованной протеиназой К, тщательно перемешайте, сбросьте капли центрифугированием.

    ! Раствор протеиназы К после приготовления хранить в морозилке при −20 °С.

  3. При наличии осадка в сорбирующем растворе и промывочном растворе А прогрейте их в термостате до температуры не выше 50 °С и дождитесь полного растворения осадка.

Работы следует выполнять при комнатной температуре, все центрифугирования (если иное прямо не оговорено) при 10000–13000 об/мин (6700–11000 x g).

Выделение ДНК из тканей растений и животных

В качестве образца для выделения ДНК рекомендуется брать 20–40 мг ткани животного и 50–100 мг ткани растения.

  1. (А) В случае использования пестика-гомогенизатора:
    1. Поместите в 1.5 мл пробирку кусочек ткани.
    2. Добавьте к образцу
      • 200 мкл лизирующего раствора AS,
      • 70–100 мг корунда.
    3. Гомогенизируйте образец с помощью пестика-гомогенизатора.
    4. Добавьте к гомогенату еще 300 мкл лизирующего раствора AS. Перемешайте.
  1. (Б) В случае использования фарфоровой ступки:
    1. В ступку поместите кусочек ткани.
    2. Добавьте к образцу
      • 100 мкл деионизованной воды,
      • 200 мкл лизирующего раствора AS,
      • 300–500 мг корунда
    3. Гомогенизируйте образец в ступке.
    4. Добавьте в гомогенату еще 300 мкл лизирующего раствора AS, перемешайте.
    5. Перенесите смесь в 1.5 мл пробирку.
  2. Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
  3. Добавьте к образцу
    • 5 мкл раствора РНКазы,
    • 10 мкл раствора протеиназы К,
    Перемешайте.
  4. Инкубируйте полученную смесь 20 мин при +55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
  5. Добавьте к образцу 350 мкл сорбирующего раствора. Перемешайте полученную смесь на вортексе до гомогенного состояния.
  6. Центрифугируйте образец в течение 10 мин.
  7. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку супернатант (не более 800 мкл), центрифугируйте 60 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  9. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
  10. Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–100 мкл предварительно прогретого до +55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из соскоба буккального эпителия

  1. Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
  2. Внесите в 1.5 мл пробирку 500 мкл лизирующего раствора AS и тщательно промойте в ней палочку с соскобом буккального эпителия.
  3. Добавьте в пробирку 10 мкл раствора протеиназы К, перемешайте.
  4. Инкубируйте полученную смесь 10 мин при +55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
  5. Добавьте к образцу 300 мкл сорбирующего раствора. Перемешайте полученную смесь на вортексе до гомогенного состояния.
  6. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
  9. Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–100 мкл предварительно прогретого до +55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из цельной крови

Данный набор позволяет выделить ДНК из 100 мкл цельной крови (свежая или замороженная кровь, содержащая в качестве антикоагулянта ЭДТА, цитрат натрия, гепарин). Перемешайте переворачиванием пробирку с кровью, чтобы содержимое пробирки стало гомогенным, после чего отберите 100 мкл образца в отдельную 1.5 мл пробирку.

  1. Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
  2. Смешайте в 1.5 мл пробирке 100 мкл цельной крови и 400 мкл лизирующего раствора AS.
  3. Добавьте в пробирку 10 мкл раствора протеиназы К, перемешайте.
  4. Инкубируйте полученную смесь 10 мин при +55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
  5. Добавьте к образцу 300 мкл сорбирующего раствора. Перемешайте полученную смесь на вортексе до гомогенного состояния.
  6. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  8. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
  9. Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–100 мкл предварительно прогретого до +55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из лейкоцитов

Предварительное выделение лейкоцитов обеспечивает более высокий выход ДНК по сравнению с выделением ДНК из цельной крови. Рекомендуемый объём цельной крови для выделения лейкоцитов – 1 мл.

  1. Для выделения лейкоцитов из 1 мл цельной крови приготовьте 9 мл 1х раствора для лизиса эритроцитов: в 15 мл пробирке смешайте 900 мкл 10х раствора для лизиса эритроцитов и 8.1 мл деионизованной воды.
  2. Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
  3. В 15 мл пробирке смешайте 1 мл цельной крови и 9 мл 1х раствора для лизиса эритроцитов, перемешайте и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте пробирку 5 мин, 300 x g, надосадочную жидкость слейте, лейкоциты находятся в осадке.
  5. Ресуспендируйте осадок клеток в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию в новую 1.5 мл пробирку.
  6. Добавьте в пробирку
    • 400 мкл лизирующего раствора AS,
    • 5 мкл раствора РНКазы,
    • 10 мкл раствора протеиназы К,
    Перемешайте.
  7. Инкубируйте полученную смесь 10 мин при +55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
  8. Добавьте к образцу 300 мкл сорбирующего раствора. Перемешайте полученную смесь на вортексе до гомогенного состояния.
  9. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  10. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  11. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
  12. Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–100 мкл предварительно прогретого до +55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Выделение ДНК из культур клеток животных и бактерий

Для выделения ДНК рекомендуется брать не более 5x106 животных клеток и 109 клеток грам-отрицательных бактерий.

Адгезионная культура клеток животных: удалите культуральную жидкость, снимите культуру клеток с поверхности пластика трипсином или другим рекомендованным для данной культуры методом. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 x g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую 1.5 мл пробирку.

Суспензионная культура клеток животных: отберите объём культуральной жидкости, содержащий необходимое число клеток. Центрифугируйте клетки 5 мин, 300 x g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую 1.5 мл пробирку.

Бактериальная культура: бактерии, выращенные на твердой или жидкой питательной среде, соберите центрифугированием в течение 5–10 минут, 3000–5000 x g. Удалите супернатант. Ресуспендируйте находящиеся в осадке клетки в 100 мкл PBS. Перенесите суспензию клеток в новую 1.5 мл пробирку.

  1. Установите термостат на 55 °С, поместите в него пробирку с элюирующим буфером.
  2. Добавьте в пробирку с образцом
    • 400 мкл лизирующего раствора AS,
    • 5 мкл раствора РНКазы,
    • 10 мкл раствора протеиназы К,
    Перемешайте.
  3. Инкубируйте полученную смесь 10 мин при +55 °С, периодически перемешивая на вортексе (1–2 раза).
  4. Добавьте к образцу 300 мкл сорбирующего раствора. Перемешайте полученную смесь на вортексе до гомогенного состояния.
  5. Поместите колонку в пробирку для сбора проскока, перенесите на колонку лизат, центрифугируйте 45 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  6. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора A, центрифугируйте 30 сек. Поместите колонку в новую пробирку для сбора проскока.
  7. Нанесите на колонку 500 мкл промывочного раствора B, центрифугируйте 3 мин.
  8. Поместите колонку в новую 1.5 мл пробирку, нанесите в центр колонки 50–100 мкл предварительно прогретого до +55 °С элюирующего буфера. Инкубируйте 1 мин при комнатной температуре. Центрифугируйте 60 сек. Выделенная ДНК находится в элюате.

Примечание

Для наибольшей концентрации ДНК используйте меньшие объёмы элюирующего буфера. Не рекомендуется использовать менее 50 мкл, так как мембрана колонки может не полностью смочиться, что приведет к частичной потере ДНК. Для наибольшего выхода ДНК с колонки используйте больший объём элюирующего буфера (100 мкл).

Элюция ДНК прогретым до +55 °С элюирующим буфером обеспечивает оптимальный выход ДНК с колонки. Элюция непрогретым элюирующим буфером (при комнатной температуре) также допустима, однако это заметно снижает выход ДНК (на 30–50 %).

Для максимального выхода ДНК рекомендуется проводить элюцию в два этапа.

При необходимости элюция может проводиться деионизованной водой.

Если необходимо разбавить раствор при измерении концентрации ДНК, то для разбавления следует использовать только буфер ТЕ pH 8.5 или элюирующий буфер из набора. В противном случае можно получить некорректные значения A260/A280 и неверно определить содержание ДНК в растворе.

Хранение выделенной ДНК: в морозильной камере (−20 °С), кратковременно при +4 °С.

Пример электрофореграммы ДНК, выделенной из различных источников

Пример электрофореграммы ДНК

1 — Esherichia coli; 2 — Agrobacterium tumifaciens; 3 — Bacillus subtilis; 4 — Pichia pastoris; 5 — Fusarium graminearum; 6 — Лист клевера (Trifolium); 7 — Лист тимофеевки (Phleum); 8 — Лист калины; 9 — Хвоя ели (Picea); 10 — Сердце мыши; 11 — Почка мыши; 12 — Печень мыши; 13 — Легкое мыши; 14 — Хвост мыши. Маркер длин ДНК 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), верхняя полоса 20 000 пн.

Кривые амплификации фрагмента гена бета-актина человека

Кривые амплификации фрагмента гена бета-актина человека

В качестве матрицы для ПЦР в реальном времени были использованы образцы геномной ДНК, выделенные из цельной крови (1,2), соскоба буккального эпителия (3,4) и лейкоцитов (5,6) (указаны пороговые циклы (Ct) и приведена электрфореграмма исходных образцов ДНК). Размер амплифицируемого фрагмента 250 пн, ПЦР в реальном времени проводили с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I (Lumiprobe). Маркер длин ДНК 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific), верхняя полоса 20 000 пн.

Sie haben den Artikel in den Warenkorb gelegt.. Warenkorb ansehen oder zur Kasse gehen
Die eingegebene Zahl ist falsch..