Das Kit dient der hochsensitiven fluoreszenzbasierten Bestimmung der Proteinkonzentration. Der Farbstoff ProteOrange fluoresziert in freier Form nur schwach. Nach einer selektiven Bindung an Proteine unter Bildung von Farbstoff-Protein-Komplexen zeigt er bei Anregung mit Blaulicht eine ausgeprägte Fluoreszenz. Die Fluoreszenzmethode der Proteinquantifizierung mit ProteOrange ist wesentlich empfindlicher als bestehende spektrophotometrische und andere herkömmliche Methoden zur Quantifizierung von Proteinmengen (Lowry, Bradford, BCA).
Der an Proteine gebundene Farbstoff ProteOrange weist ein Anregungsmaximum bei ~485 nm und ein Emissionsmaximum bei ~590 nm auf. Das Kit eignet sich für jedes Fluorometer, das über eine entsprechende Anregungslichtquelle und einen Detektionskanal verfügt. Sie können mit einem Küvetten-Fluorometer eine Proteinkonzentration zwischen 10 ng/ml und 10 µg/ml, mit einem Mikroplatten-Fluorometer eine Proteinkonzentration zwischen 100 ng/ml und 10 µg/ml bestimmen.
Bestandteile
Komponente | Anzahl | |
---|---|---|
14102 1 mL dye |
||
41210, ProteOrange Reagenz zur Proteinquantifizierung / ProteOrange protein quantification reagent, 500×, 1 mL | 1 | |
A6650, Protein-Standard / Protein standard, BSA 2 mg/ml in ТЕ-Puffer, 500 uL | 1 | |
S2750, ProteOrange Puffer zur Proteinquantifizierung / ProteOrange protein quantification buffer, 10x, 50 mL | 1 |
Bei +4 °С lagern. Reagenzien vor Gebrauch auf +20 °C temperieren.
Haltbarkeit: 12 Monate.
Verfahren
Das nachstehende Protokoll wurde für die Proteinquantifizierung mit einem Mikroplatten-Fluorometer mit einem Probenvolumen von 200 µl (96-Well-Mikrotiterplatte) entwickelt. Sollten Sie ein Fluorometer mit einem anderen Probenvolumen benutzen (z. B. ein Küvetten-Fluorometer mit einem Probenvolumen von 2 ml für eine Standardküvette), sind alle Volumina dementsprechend umzurechnen.
Das Protokoll beinhaltet einen Inkubationsschritt der Proben bei 90–95 °С für 10 Minuten zur Proteindenaturierung und Stabilisierung der Fluoreszenz der Proben. Standards und Proben sollen laut Protokoll in separaten Röhrchen angesetzt, erhitzt und in eine Mikrotiterplatte für die Fluoreszenzmessung überführt werden. Wenn Sie jedoch über eine entsprechende Ausstattung verfügen, können Sie Standards und Proben direkt in einer Mikrotiterplatte ansetzen, diese mit einer hitzebeständigen Verschlussfolie oder einem Deckel verdunstungssicher verschließen und die Proben gemäß dem Protokoll erhitzen. Nach Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur zentrifugieren Sie kurz an, um das Kondensat mit der Reaktionslösung zu vereinigen, und fahren Sie wie im Protokoll angegeben fort.
- Ansetzen der 1× ProteOrange Pufferlösung. Stellen Sie eine ausreichende Menge der 1× ProteOrange-Pufferlösung unter Berücksichtigung von Volumen und Anzahl von Proben (s. Punkt 4) und Standards (s. Punkt 3) her. Sie erhalten 1× Puffer, indem Sie 10× ProteOrange Pufferkonzentrat 10-fach mit deionisiertem Wasser verdünnen.
- Ansetzen der ProteOrange Farbstoffarbeitslösung. Setzen Sie ProteOrange Farbstoffarbeitslösung an. Verdünnen Sie dafür 500× ProteOrange Farbstoffkonzentrat 500-fach mit 1× ProteOrange Pufferlösung. Sie benötigen beispielsweise für 3 Proben (s. Punkt 4, Beispiel #1) und 10 Standards (s. Punkt 3) ~4 ml der 1× ProteOrange Pufferlösung und 4 ml der Farbstoffarbeitslösung (mischen Sie 8 µl des ProteOrange Farbstoffkonzentrats und 4 ml der 1× ProteOrange Pufferlösung). ! Die angesetzte Farbstoffarbeitslösung ist innerhalb von wenigen Stunden aufzubrauchen. Erfolgt die Messung nicht sofort, lagern Sie die angesetzte Farbstoffarbeitslösung lichtgeschützt. ! Verwenden Sie zur Herstellung der Farbstoffarbeitslösung ausschließlich Kunststoffgefäße. Ein Glasgefäß kann den Farbstoff adsorbieren, was zur Verringerung der Farbstoffkonzentration in den Proben und Beeinflussung der Messergebnisse führen kann.
- Ansetzen der Protein-Standards.
Mit Hilfe von Protein-Standards wird eine Kalibrationskurve erstellt, mit der die Umrechnung der
Fluoreszenzintensität einer Probe in die Proteinkonzentration erfolgt. Die Kalibrationskurve berücksichtigt
die Variabilität der Ergebnisse bei Messungen mit verschiedenen Fluorometern, Variabilität der an einem
Fluorometer gemessenen Ergebnisse verschiedener Messreihen sowie Pipettierfehler bei Herstellung der
Farbstoffarbeitslösung. Es ist daher empfehlenswert, eine neue Kalibrationskurve für jede
Messreihe zu erstellen. Sie können jedoch auch eine zuletzt validierte Kalibrationskurve benutzen,
wenn Sie unter gleich gebliebenen Bedingungen messen.
Verwenden Sie zum Erstellen einer Kalibrationskurve am besten dasselbe Protein, dessen Konzentration Sie in der
Probe bestimmen möchten. Wenn das nicht möglich ist, nehmen Sie den im Kit enthaltenen
BSA-Proteinstandard 2 mg/ml.
Der Messbereich dieses Kits beträgt 10 ng/ml—10 μg/ml für ein Küvetten-Fluorometer,
100 ng/ml—10 µg/ml für ein Mikroplatten-Fluorometer. Abhängig von der geschätzten
Proteinkonzentration in Proben und dem zur Verfügung stehenden Fluorometer, können Sie eine
Kalibrationskurve entweder für den Gesamtmessbereich oder lediglich für einen Teilbereich des Kits
erstellen.
Nachfolgend finden Sie ein Schema zum Ansetzen der BSA-Standards für den gesamten Messbereich des Kits für
ein Mikroplatten-Fluorometer (100 ng/ml—10 μg/ml) und ein Probenvolumen 200 μl (für
eine 96-Well-Plate):
- 3.1. Setzen Sie in separaten 1,5-ml-Röhrchen BSA-Stammlösungen mit einer Konzentration
von 10 μg/ml und 1 μg/ml aus Protein-Standard BSA 2 mg/ml und ProteOrange
Farbstoffarbeitslösung wie folgt an:
- 10 μg/ml: 5 μl Protein-Standard, BSA 2 mg/ml in ТЕ-Puffer + 995 μl ProteOrange Farbstoffarbeitslösung
- 1 μg/ml: 100 μl BSA-Stammlösung 10 μg/ml + 900 μl ProteOrange Farbstoffarbeitslösung
- 3.2. Verwenden Sie die angesetzten BSA-Stammlösungen zum Herstellen der BSA-Standards in separaten 1,5-ml-Röhrchen laut Tabelle:
- 3.1. Setzen Sie in separaten 1,5-ml-Röhrchen BSA-Stammlösungen mit einer Konzentration
von 10 μg/ml und 1 μg/ml aus Protein-Standard BSA 2 mg/ml und ProteOrange
Farbstoffarbeitslösung wie folgt an:
BSA-Stammlösung* | Volumen der BSA-Stammlösung, μl | Volumen der ProteOrange Farbstoffarbeitslösung, μl | BSA-Endkonzentration, μg/ml |
---|---|---|---|
0 | 250 | 0 | |
10 μg/ml | 250 | 0 | 10 |
200 | 50 | 8 | |
100 | 150 | 4 | |
50 | 200 | 2 | |
1 μg/ml | 250 | 0 | 1 |
200 | 50 | 0,8 | |
100 | 150 | 0,4 | |
50 | 200 | 0,2 | |
25 | 225 | 0,1 | |
*die im Punkt 3.1. mit ProteOrange Farbstoffarbeitslösung angesetzten Stammlösungen |
Liegt die geschätzte Proteinkonzentration in Proben in einem Ihnen bekannten engeren Teilbereich, so können Sie nur eine BSA-Stammlösung mit den dazugehörigen Standards ansetzen, so dass die Kalibrationskurve den geschätzten Konzentrationsbereich des Proteins abdeckt. Liegt die Proteinkonzentration beispielsweise im Bereich zwischen 2 und 10 μg/ml, müssen Sie lediglich eine BSA-Stammlösung mit einer Konzentration von 10 μg/ml (s. Punkt 3.1) ansetzen. Aus dieser Stammlösung stellen Sie dann die BSA-Standards mit folgenden Konzentrationen: 0, 10, 8, 4, 2 μg/ml für die Messung mit dem Fluorometer her (s. Tabelle Punkt 3.2).
- Herstellung der Proben
Mischen Sie in einem separaten Röhrchen die zu untersuchende Probe mit der ProteOrange
Farbstoffarbeitslösung. Wir empfehlen, die Ausgangsprobe mehr als 20-fach zu verdünnen, so dass
ihr Anteil am Messvolumen 5 % nicht übersteigt. Diese Empfehlung berücksichtigt die
Farbstoffmenge, die an das zu untersuchende Protein bindet sowie die maximale Verdünnung der in der
Ausgangsprobe vorhandenen Verunreinigungen, wodurch ihr Einfluss auf Messergebnisse minimiert wird.
Beispiel #1: Mischen Sie 5 μl Ausgangsprobe und 195 μl
ProteOrange-Farbstoffarbeitslösung
zur Herstellung von 200 μl der zu messenden Probe (eine 40-fache Verdünnung).
Beispiel #2 (bei hoher Konzentration der Verunreinigungen in der Ausgangsprobe): Stellen Sie
zwei
aufeinander folgende Verdünnungen der Ausgangsprobe in der ProteOrange Farbstoffarbeitslösung
her:
- 20× Verdünnung: Mischen Sie 13 μl der Ausgangsprobe mit 247 μl der ProteOrange Farbstoffarbeitslösung
- 100× Verdünnung: Mischen Sie 50 μl der 20× Verdünnung und 200 μl der ProteOrange Farbstoffarbeitslösung
- Inkubieren Sie alle Röhrchen (mit Standards und Proben) lichtgeschützt für 10 Minuten bei 90–95 °С.
- Lassen Sie die Röhrchen ebenfalls lichtgeschützt auf Raumtemperatur abkühlen (ca. 15–20 min).
- Zentrifugieren Sie kurz an, um das Kondensat mit der Reaktionslösung zu vereinigen.
- Überführen Sie 200 μl je Probe und Protein-Standard in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
- Fluoreszenzmessung Wählen Sie den geeigneten Anregungs- und Detektionskanal: Der an Proteine gebundene Farbstoff ProteOrange weist ein Absorptionsmaximum bei ~485 nm und ein Emissionsmaximum bei ~590 nm auf.
- Erstellen Sie eine Kalibrationskurve anhand der gemessenen Standard-Fluoreszenzwerte. Finden Sie unter Verwendung der polynomialen Approximation eine Gleichung, die die Abhängigkeit der Proteinkonzentration (μg/ml) von der Fluoreszenzintensität (RFU) beschreibt und ermitteln Sie dadurch die Proteinkonzentration in Proben.
Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität des BSA-ProteOrange-Komplexes von der BSA-Konzentration. Die BSA-Konzentration liegt im Bereich zwischen 100 ng/ml und 10 μg/ml. Fluoreszenzmessung mit einem Mikroplatten-Fluorometer, Anregungs- und Detektionskanäle mit 485/10 bzw. 575/20 nm.
Related kits
ProteOrange Protein-Quantifizierungskit
Das fluoreszenzbasierte ProteOrange Protein-Quantifizierungskit erlaubt eine wesentlich empfindlichere Proteinbestimmung als bestehende spektrophotometrische und andere herkömmliche Methoden zur Quantifizierung von Proteinmengen (Lowry, Bradford, BCA).Artikel-Nr. | Packungseinheit | Preis | Vorlaufzeit | Jetzt kaufen |
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A4102 |
100 uL dye
|
– | 1 Tagen. | |
14102 |
1 mL dye
|
$415 | 1 Tagen. |