Protokoll: qPCR mit dsGreen oder SYBR Green I

dsGreen, ein Analogon zu SYBR® Green I, ist ein sehr empfindlicher Farbstoff für den Nachweis von doppelsträngiger DNA. Beide werden gleichermaßen für den unspezifischen Nachweis von Amplifikaten in qPCR-Experimenten eingesetzt.

  1. Falls das dsGreen-Reagenz gefroren gelagert wurde, lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen. Zum schnelleren Auftauen kann das Reagenz vorübergehend auf bis zu 50 °C erwärmt werden.
  2. Berechnen Sie die Volumina der für die Reaktion benötigten Ragenzien.
    Reagenz Endkonzentration im Reaktionsansatz
    dNTPs je 2 mM
    DMSO 10 % (v/v)
    Taq-Polymerasepuffer
    Primer 1 0,1−1 µM
    Primer 2 0,1−1 µM
    Taq-DNA-Polymerase 1,25 units je Ansatz
    MgCl2 2 mM
    dsGreen
  3. Stellen Sie auf Eis einen 1× Mastermix ohne DNA her, indem Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge mischen: Wasser, DMSO, Taq-Polymerasepuffer, dNTPs, MgCl2, dsGreen, Taq-Polymerase, Primer.
  4. Verteilen Sie den Mastermix auf die einzelnen Reaktionsgefäße und geben Sie die DNA hinzu.
  5. Gestalten Sie das PCR-Programm entsprechend den Hinweisen von Polymerase- und Gerätehersteller.

Anmerkungen:

Führen Sie stets Positiv- und Negativkontrollen mit, wenn Sie qPCR-Experimente durchführen. Das Temperaturprogramm für die qPCR unterscheidet sich nicht von dem Standard-PCR-Programm für das gegebene DNA-Template und die gewählten Primer. Für die Detektion ist der FAM- bzw. SYBR-Green-Kanal zu verwenden.

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