Protokoll: qPCR mit dsGreen oder SYBR Green I

dsGreen, ein Analogon zu SYBR^® Green I, ist ein sehr empfindlicher Farbstoff für den Nachweis von doppelsträngiger DNA. Beide werden gleichermaßen für den unspezifischen Nachweis von Amplifikaten in qPCR-Experimenten eingesetzt.

Falls das dsGreen-Reagenz gefroren gelagert wurde, lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen. Zum schnelleren Auftauen kann das Reagenz vorübergehend auf bis zu 50 °C erwärmt werden.

Berechnen Sie die Volumina der für die Reaktion benötigten Ragenzien.

Reagenz	Endkonzentration im Reaktionsansatz
dNTPs	je 2 mM
DMSO	10 % (v/v)
Taq-Polymerasepuffer	1×
Primer 1	0,1−1 µM
Primer 2	0,1−1 µM
Taq-DNA-Polymerase	1,25 units je Ansatz
MgCl₂	2 mM
dsGreen	1×

Stellen Sie auf Eis einen 1× Mastermix ohne DNA her, indem Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge mischen: Wasser, DMSO, Taq-Polymerasepuffer, dNTPs, MgCl₂, dsGreen, Taq-Polymerase, Primer.
Verteilen Sie den Mastermix auf die einzelnen Reaktionsgefäße und geben Sie die DNA hinzu.
Gestalten Sie das PCR-Programm entsprechend den Hinweisen von Polymerase- und Gerätehersteller.

Anmerkungen:

Führen Sie stets Positiv- und Negativkontrollen mit, wenn Sie qPCR-Experimente durchführen. Das Temperaturprogramm für die qPCR unterscheidet sich nicht von dem Standard-PCR-Programm für das gegebene DNA-Template und die gewählten Primer. Für die Detektion ist der FAM- bzw. SYBR-Green-Kanal zu verwenden.

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Artikel-Nr.	Packungseinheit	Preis	Vorlaufzeit
11010	100 uL	$39.00	Auf Lager
41010	1 mL	$310.00	Auf Lager
51010	1.5 mL	$450.00	Auf Lager
61010	2 mL	$498.00	Auf Lager
71010	5 mL	$845.00	Auf Lager
81010	10 mL	$1190.00	Auf Lager
91010	50 mL	$4450.00	Auf Lager