Handbuch für das PKH Kits für die Zellmembranmarkierung

PKH-Cyanin-Farbstoffe enthalten lipophile Gruppen, die ihre schnelle und nicht-kovalente Integration in die Membranen fast jeder Zelle ermöglichen, ohne die Zellrezeptoren oder Transmembranproteine zu beeinflussen. Die Zellen bewahren ihre biologischen Eigenschaften und ihre Fähigkeit zur Proliferation, was PKH-Farbstoffe nützlich macht, um Pflanzen- und Tierzellen in vivo und in vitro zu untersuchen. Diese Farbstoffe können auch zur Untersuchung von Membranvesikeln verwendet werden.

Dieses gebrauchsfertige Kit enthält alle notwendigen Reagenzien, um Zellmembranen mit PKH-Farbstoffen zu markieren und die Zellmigration oder -proliferation zu bewerten.

Bestandteile

Komponente Anzahl
13201
100 uL dye, 1x buffer 		23201
100 uL dye, 5x buffer 		33201
500 uL dye, 1x buffer 		43201
500 uL dye, 5x buffer 		14201
100 uL dye, 1x buffer 		24201
100 uL dye, 5x buffer 		34201
500 uL dye, 1x buffer 		44201
500 uL dye, 5x buffer 		17201
100 uL dye, 1x buffer 		27201
100 uL dye, 5x buffer 		37201
500 uL dye, 1x buffer 		47201
500 uL dye, 5x buffer
2484-100uL, Farbstoff PKH26, 1 mM Lösung in Isopropanol, 100 uL 1 1 5 5 — — — — — — — —
K6150, PKH-Farbstoffpufferlösung, 1x, 10 mL 5 — 25 — 5 — 25 — 5 — 25 —
K7150, PKH-Farbstoffpufferlösung, 5x, 10 mL — 1 — 5 — 1 — 5 — 1 — 5
2485-100uL, Farbstoff PKH2, 1 mM Lösung in Isopropanol, 100 uL — — — — 1 1 5 5 — — — —
2801-100uL, Farbstoff PKH800, 1 mM Lösung in Isopropanol, 100 uL — — — — — — — — 1 1 5 5

Bei 4 °С lagern. Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur temperieren.

Haltbarkeit: 12 Monate.

Anwendungsempfehlungen:

  • Die optimalen Farbstoff- und Zellkonzentrationen können abhängig von Zelltyp und Versuch variieren. Es wird daher empfohlen, nach der Färbung die Zellvitalität sowie Fluoreszenzhomogenität und -intensität auszuwerten.
  • Benutzen Sie keine azidhaltigen Lösungen bei Färbung mit den PKH-Farbstoffen.
  • Die Verwendung einer Zellsuspension liefert eine homogenere Zellfärbung.

Kitprotokoll

Kitprotokoll für die Markierung von Zellmembranen mit dem Farbstoffe PKH am Beispiel der Haftkultur RAW264.7, 1×106 Zellen pro Probe mit einer PKH-Endkonzentration von 2 µM und dem Endvolumen von 200 µl.

  1. Stellen Sie eine PKH-Färbelösung frisch vor der Färbung her. Mischen Sie dafür 1 µl einer PKH-Lösung (PKH dye, 1 mM solution in isopropanol) und 9 µl 96%igen Ethanols. Entnehmen Sie 4 µl der hergestellten Lösung und geben Sie sie zu 100 µl PKH Dyes Diluent, 1x.
    *1x PKH Dyes Diluent ist entweder in gebrauchsfertiger Form (K6150, PKH Dyes Diluent, 1x) oder als 5x Konzentrat (K7150, PKH Dyes Diluent, 5x) erhältlich. Verwenden Sie zum Verdünnen von 5x PKH Dyes Diluent steriles bidestilliertes Wasser.
  2. Lösen Sie die Zellen mit einem Zellschaber in Hanks’ BSS (HBSS) ab. Zählen Sie die Zellen in der Probe. Fügen Sie 3 ml von Hanks’ BSS und zentrifugieren Sie 6 Minuten lang bei 400 x g und Raumtemperatur.
    *Der Farbstoff wird ebenfalls von Serumproteinen und -lipiden gebunden, deshalb ist ein einmaliger Waschschritt mit serumfreiem Medium oder PBS-Puffer empfohlen.
  1. Pipettieren Sie den Überstand komplett ab und resuspendieren Sie die benötigte Zellzahl (zum Beispiel 1×106 Zellen) in 100 µl PKH Dyes Diluent, 1x. Fügen Sie 100 µl der im Schritt 1 hergestellten PKH-Lösung hinzu. Pipettieren Sie und lassen Sie den Ansatz für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die PKH-Endkonzentration in der Zelllösung beträgt 2 µM.
    *Für reproduzierbare Ergebnisse ist es wichtig, den Überstand vor dem Resuspendieren der Zellen möglichst vollständig abzunehmen.
    *Lassen Sie die Zellen nicht lange in PKH Dyes Diluent.
    *Da die Färbung fast sofort eintritt, ist eine schnelle Verteilung der Zellen in der Farbstofflösung für eine helle, homogene und reproduzierbare Markierung entscheidend.
  2. Stoppen Sie die Reaktion mit 2 ml fötalem Kälberserum ab und inkubieren Sie für 1 Minute. Zentrifugieren Sie bei 400 x g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    3. *Verwenden Sie zum Abstoppen der Reaktion keine serumfreie Medien oder Pufferlösungen, die zur Bildung von Farbstoffaggregaten führen.
  3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml eines Kulturmediums. Überführen Sie die Lösung in ein neues Reaktionsgefäß. Entnehmen Sie Aliquots für die Beurteilung der Zellvitalität mit Trypanblau. Zentrifugieren Sie bei 400 x g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Resuspendieren Sie die Zellen im jeweiligen für die weiteren Untersuchungen (Mikroskopie, Durchflusszytometrie u. a.) bestimmten Puffer.
    *Die gefärbten Zellen können mit einer 2%igen Paraformaldehyd-Lösung fixiert werden. Bei einer lichtgeschützten Lagerung der Proben bleibt die Färbung mindestens drei Wochen lang stabil.

Lagerung:

PKH-Lösung kann bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank lichtgeschützt gelagert werden. Es wird empfohlen, die Lösung vor Gebrauch auf Bodensatzbildung zu kontrollieren. Eventuelle Bodensätze können durch leichtes Erwärmen im Wasserbad auf 37 °C und anschließend durch Ultraschall oder Schütteln gelöst werden.

PKH Dyes Diluent wird als sterile 1x- oder 5x-Lösung geliefert. Die Lösung sollte im Kühlschrank gelagert und erst unmittelbar vor Gebrauch auf Raumtemperatur gebracht werden.

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