Handbuch für das Pico488 dsDNA-Quantifizierungskit

Pico488 dsDNA-Quantifizierungskit dient der Bestimmung niedriger dsDNA‑Konzentrationen, die mittels spektrophotometrischer Methode bei 260 nm nicht detektiert werden können. Pico488 Reagenz bindet selektiv an die doppelsträngige DNA, sodass Nukleotide, einzelsträngige DNA, RNA, Proteine und andere Verunreinigungen keinen Einfluss auf die Messergebnisse haben.

Der lineare Bereich für die DNA-Konzentrationsbestimmung mit dem Kit reicht von 1 pg/µl bis 5 ng/µl. Der an die doppelsträngige DNA gebundene Farbstoff weist ein Absorptionsmaximum bei 503 nm und ein Emissionsmaximum bei 525 nm auf. Messungen können mit jedem Fluorometertyp durchgeführt werden.

Bestandteile

Komponente Anzahl
1102-200
200 assays
B1102
200 assays
42010, Pico488 für die dsDNA-Quantifizierung, 200x-Lösung in DMSO, 1 mL 1
12010, Pico488 für die dsDNA-Quantifizierung, 200x-Lösung in DMSO, 100 uL 10
N2150, TE‑Puffer, 20x, 25 mL 1 1
B8650, dsDNA-Standard / dsDNA quantitative standard, 100 ng/uL in TE‑Puffer, 1 mL 1 1

Unter 4 °C lagern. Nicht einfrieren!

Haltbarkeit: 12 Monate.

Die oben aufgeführte Reagenzienmenge reicht für ca. 200 Messungen inkl. Proben und Standards bei einem Messvolumen von 2 ml (das Mindestmessvolumen für eine 3,5 ml Makroküvette). Die Anzahl der Messungen kann sich je nach Messvolumen ändern. Die empfohlenen Messvolumina für die gängigen fluorometrischen Geräte sind in der nachstehenden Tabelle angeführt.

Empfohlene Messvolumina für die DNA-Konzentrationsbestimmung mit Pico488 Farbstoff:

Gerätetyp Messvolumen (VProbe) Volumen der Pico488 Farbstoffarbeitslösung Volumen verdünnter DNA‑Probe
Küvetten-Fluorometer 3,5 ml Küvette 2 ml 1 ml 1 ml
Andere Küvetten ca. 75 % des Küvettenvolumens 37,5 % des Küvettenvolumens 37,5 % des Küvettenvolumens
Mikroplatten-Fluorometer 96-Well-Mikroplatte*, pro Well 0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml
24-Well-Mikroplatte*, pro Well 1 ml 0,5 ml 0,5 ml
Andere Mikroplatten ca. 75 % des Wellvolumens 37,5 % des Wellvolumens 37,5 % des Wellvolumens
NanoDrop™ 3300* 0,1 ml 0,05 ml 0,05 ml

*Es ist empfohlen, ein Pipettiervolumen von weniger als 2 μl zu vermeiden, um die Genauigkeit und Präzision der Messungen zu gewährleisten.

Verfahren

! Um mögliche Pipettierverluste auszugleichen, stellen Sie einen 10–25 % Überschuss der 1x TE Pufferlösung und Farbstoffarbeitslösung her.

1. Ansetzen der 1x TE Pufferlösung

Stellen Sie eine ausreichende Menge der 1x TE Pufferlösung unter Berücksichtigung von Messvolumen und Probenanzahl her (inkl. 5 Verdünnungen des dsDNA-Standards, siehe Punkt 3). Den 1х ТЕ Puffer erhalten Sie, indem Sie 20x TE Konzentrat mit deionisiertem Wasser 20-fach verdünnen (prüfen Sie das empfohlene Messvolumen für das verwendete Gerät anhand der Tabelle).

Verwenden Sie zur Berechnung des Puffervolumens (V1х Puffer) folgende Formel:

V1х Puffer = VProbe × (NProben+ 5),

wo VProbe — Volumen einer Probe oder eines Standards, NProben — Anzahl der Proben und 5 — Anzahl der DNA-Standards (inkl. der Leerprobe).

2. Ansetzen der Farbstoffarbeitslösung

Tauen Sie das Farbstoffröhrchen auf und mischen Sie den Röhrcheninhalt gründlich. Setzen Sie eine ausreichende Menge der Arbeitslösung unter Berücksichtigung der Probenanzahl an. Das Volumen der Pico488 Farbstoffarbeitslösung muss 50 % des Messvolumens betragen. Stellen Sie die Farbstoffarbeitslösung her, indem Sie 200x Pico488 Farbstoffkonzentrat mit 1х ТЕ Puffer 200-fach verdünnen.

! Angesetzte Farbstoffarbeitslösung ist innerhalb von 3 Stunden aufzubrauchen.

Verwenden Sie zur Berechnung des Volumens der Pico488 Farbstoffarbeitslösung (VPico488) folgende Formel:

VPico488 = 1/2 × VProbe × (NProben+ 5),

wo VProbe — Volumen einer Probe oder eines Standards, NProben — Anzahl der Proben und 5 — Anzahl der DNA-Standards (inkl. der Leerprobe).

! Verwenden Sie zur Herstellung der Farbstoffarbeitslösung ausschließlich Kunststoffgefäße. Ein Glasgefäß kann den Farbstoff adsorbieren, was zur Verringerung der Farbstoffkonzentration in den Proben und Beeinflussung der Messergebnisse führen kann.

3. Ansetzen der Standards

Stellen Sie eine DNA-Stammlösung mit einer Konzentration von 2 ng/μl in 1х ТЕ Puffer her, indem Sie 30 μl dsDNA-Standard aus dem Kit mit 1,47 ml 1х ТЕ Puffer in einem Röhrchen mischen. Stellen Sie aus dieser Stammlösung DNA‑Standardlösungen mit folgenden Konzentrationen her: 2 ng/μl, 200 pg/μl, 20 pg/μl, 2 pg/μl (siehe nachstehende Tabelle).

! Das vorgeschlagene Verdünnungsschema der DNA-Stammlösung berücksichtigt Pipettierverlüste bei der Herstellung von Verdünnungen mit einer DNA‑Endkonzentration von 0 bis 2 ng/μl. Die nach diesem Schema angesetzten 1,5 ml DNA-Stammlösung reichen für die Herstellung der DNA-Standardlösungen für Messungen in einer 3,5 ml Küvette (bei einem Messvolumen von 2 ml). Für ein kleineres Messvolumen kann ein geringeres Volumen der DNA-Stammlösung angesetzt werden.

Volumen der 1x TE Pufferlösung, μl Volumen der DNA‑Stammlösung 2 ng/μl, μl Konzentration der DNA‑Standardlösung Endkonzentration des DNA-Standards im Messvolumen
0 1000 2 ng/μl 1 ng/μl
900 100 200 pg/μl 100 pg/μl
990 10 20 pg/μl 10 pg/μl
999 1 2 pg/μl 1 pg/μl
1000 0 0 pg/μl 0 pg/μl

Mischen Sie jede DNA-Standardlösung mit der Farbstoffarbeitslösung im Verhältnis 1:1 (prüfen Sie das Messvolumen (VProbe) anhand der obigen Tabelle).

! Stellen Sie einen nicht linearen Verlauf der Kalibrierkurve an den Grenzen des dynamischen Bereichs des Gerätes fest, so passen Sie die Konzentrationen der Standardlösungen an, um die Möglichkeiten des Fluorometers optimal zu nutzen.

4. Vorbereitung der Proben

Verdünnen Sie die zu untersuchende DNA-Probe mit 1x TE-Puffer, sodass das Probenvolumen 50 % des Messvolumens beträgt (das Ausgangsvolumen der Probe kann beliebig sein, die Endkonzentration muss jedoch im Bereich von 1 pg/μl bis 5 ng/μl liegen). Fügen Sie das gleiche Volumen der Pico488 Farbstoffarbeitslösung hinzu und mischen Sie.

5. Inkubieren Sie alle hergestellten Standardlösungen und DNA-Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur.

6. Fluoreszenzmessung

Führen Sie Fluoreszenzmessungen der Standardlösungen und DNA-Proben durch (der an die doppelsträngige DNA gebundene Farbstoff weist ein Absorptionsmaximum bei 503 nm und ein Emissionsmaximum bei 525 nm auf).

7. DNA-Konzentrationsberechnung

Erstellen Sie eine Kalibrierkurve anhand der Angaben zur Fluoreszenz der Standardlösungen. Approximieren Sie diese Daten durch eine lineare Funktion und ermitteln Sie die Funktionsparameter A und B. Die lineare Abhängigkeit zwischen Fluoreszenz (FL) und Konzentration (C) sieht wie folgt aus:

FL= A × C + B , wo FL — Fluoreszenzintensität in relativen Fluoreszenzeinheiten und C — DNA-Konzentration, A und B — Parameter der linearen Funktion.

DNA-Konzentration in einer verdünnten DNA-Probe:

CProbe = (FLProbe − B)/A , wo FLProbe — Probenfluoreszenz, A und B — Parameter der ermittelten linearen Funktion.

DNA-Konzentration in der Ausgangsprobe:

Сinit = VProbe × CProbe/Vinit , wo VProbe — Messvolumen, Vinit — Volumen der Ausgangsprobe, die zur Herstellung der Endprobe (in Messvolumen) verwendet wurde.

Um notwendige Berechnungen durchzuführen, verwenden Sie unseren Rechner: Rechner für die DNA-Quantifizierung und Lösungs- und Verdünnungsrechner.

Beispiel einer linearen Regression: Fluoreszenz gegen DNA-Konzentration

Related kits

Pico488 dsDNA-Quantifizierungskit

Ein Kit für die Quantifizierung doppelsträngiger DNA mit dem Fluorophor Pico488
Preise einblenden
Artikel-Nr. Packungseinheit Preis Vorlaufzeit
1102-200 200 assays $350.00 Auf Lager
B1102 200 assays $395.00 Auf Lager

Sie haben den Artikel in den Warenkorb gelegt.. Warenkorb ansehen oder zur Kasse gehen
Die eingegebene Zahl ist falsch..