Kits zur Antikörpermarkierung

Die Kits dienen der Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern. Ein Kit enthält Reagenzien und Materialien für zehn Markierungsreaktionen mit jeweils 100 μg Antikörper. Der Fluorophor wird als NHS-Ester im kontrollierten Überschuss eingesetzt, um die Markierung eines Antikörpers mit 2,5–3 Markermolekülen zu erzielen. Bei schwach alkalischem pH-Wert reagiert der Fluorophor mit den Aminogruppen der antikörpereigenen Lysin-Seitenketten. Die Aufreinigung erfolgt anschließend mit Gelfiltrationssäulchen in der Tischzentrifuge. Die Kits enthalten sulfonierte, wasserlösliche Fluorophore, die sich sehr gut für die Markierung empfindlicher Proteine, einschließlich Antikörpern, eignen.

Bestandteile

Komponente Anzahl
1321-10rxn
10 Reaktionen
3321-10rxn
10 Reaktionen
7321-10rxn
10 Reaktionen
5321-10rxn
10 Reaktionen
6321-10rxn
10 Reaktionen
N1320, Sulfo-Cyanin 3 NHS-Ester, 1 rxn 10
N3320, Sulfo-Cyanin 5 NHS-Ester, 1 rxn 10
N7320, Sulfo-Cyanin 5.5 NHS-Ester, 1 rxn 10
N5320, Sulfo-Cyanin 7 NHS-Ester, 1 rxn 10
N6320, Sulfo-Cyanin 7.5 NHS-Ester, 1 rxn 10
Zentrifugationssäulchen zum Entsalzen, PBS 10 10 10 10 10
Auffanggefäß (1,5 ml) für die Gelfiltration 10 10 10 10 10
Abfallgefäß (2 ml) für die Gelfiltration 10 10 10 10 10
PBS-Tablette, ergibt 100 ml Puffer 1 1 1 1 1
15050, DMSO, Markierungsgüte, 1 mL 1 1 1 1 1
1584-05mL, Sodium azide solution, 3%, 0.5 mL 1 1 1 1 1
1689-15mL, Sodium bicarbonate, 126 mg 1 1 1 1 1

Lagern bei +3 °C bis +20 °C. Nicht einfrieren!

Haltbarkeit: 12 Monate.

Anleitung

1. Vorbereitung der Antikörperlösung

Die Antikörper sollten vor der Markierungsreaktion in PBS gelöst werden. Natriumazid beeinträchtigt die Reaktion nicht. Falls die Antikörperkonzentration geringer als 1 mg/ml ist, sollte die Lösung aufkonzentriert werden.

2. Reaktionsansatz

2.1 Zentrifugieren Sie den lyophilisierten Fluoreszenzfarbstoff kurz an.

2.2 Geben Sie die vorbereitete Antikörperlösung (100 μg in 100 μl*) direkt auf den lyophilisierten Fluorophor und vortexen Sie langsam. Inkubieren Sie die Reaktionslösung 30 min bei Raumtemperatur.

* Falls eine geringere Antikörpermenge markiert werden soll, lösen Sie den lyophilisierten Fluorophor in 10 μl wasserfreiem DMSO und setzen Sie 1 μl dieser Lösung pro 10 μg Antikörper ein. Die Lösung des Fluorophors in DMSO sollte unmittelbar verbraucht werden.

3. Aufreinigung der markierten Antikörper

3.1 Vorbereitung des Säulchens: Das Säulchen sollte bei Gebrauch Raumtemperatur angenommen haben. Resuspendieren Sie das Säulenmaterial durch Vortexen. Entfernen Sie zunächst den unteren Verschluss und stecken Sie das Säulchen in ein Abfallröhrchen (ohne Verschlusskappe). Entfernen Sie dann auch den oberen Deckel und zentrifugieren Sie 2 min lang mit 1.000 g, um den Puffer zu entfernen. Die Markierung am oberen Säulchenrand dient der gleichbleibenden Ausrichtung und sollte bei allen Zentrifugationsschritten nach außen weisen. Verwerfen Sie den eluierten Puffer und stecken Sie das Säulchen wieder in dasselbe Abfallröhrchen.

3.2 Geben Sie 400 μl PBS auf das Säulenmaterial und zentrifugieren Sie erneut für 2 min mit 1.000 g.

3.3 Verwerfen Sie das Abfallröhrchen mit dem eluierten Puffer und stecken Sie das Säulchen in ein Auffanggefäß (mit Deckel). Pipettieren Sie 100 μl des Reaktionsansatzes mittig auf das Säulenmaterial und eluieren Sie die Antikörper durch Zentrifugation für 2 min mit 1.000 g. Vergessen Sie dabei nicht, den Rotordeckel anzubringen. Geben Sie als Konservierungsmittel 1/100 Volumenanteil 100× Natriumazidlösung zum Eluat. Zur Langzeitlagerung empfiehlt es sich, die Antikörperlösung aliquotiert bei −20 °C einzufrieren. Die Gebrauchslösung sollte bei 4 °C gelagert werden.

4. Bestimmung des Verhältnisses von Farbstoff zu Antikörper

Um das Mengenverhältnis des Fluoreszenzfarbstoffs zum Antikörper zu bestimmen, nehmen Sie ein Absorptionsspektrum des Konjugats auf oder messen Sie die Absorption bei 280 nm (AAB) und am Absorptionsmaximum des Fluorophors (ADye). Ein typisches Absorptionsspektrum eines markierten Antikörpers ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Die Wellenlänge des Absorptionsmaximums hängt dabei von der Wahl des Fluoreszenzfarbstoffs ab.

Labeled antibody absorption spectrum

Das Absorptionsspektrum eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers weist einen Antikörperpeak (bei etwa 280 nm) und einen Farbstoffpeak (mit größerer Wellenlänge) auf. Das Mengenverhältnis des Farbstoffs zum Antikörper berechnet sich nach folgender Formel:

Calculation of dye to antibody ratio

mit Dye/AB = durchschnittliches Verhältnis von Fluorophor- zu Antikörpermolekülen, ADye = optische Dichte der Probe am Absorptionsmaximum des Fluorophors, AAB = optische Dichte der Probe bei 280 nm, εAB = molarer Extinktionskoeffizient des Antikörpers bei 280 nm (210.000 für IgG), εDye = molarer Extinktionskoeffizient des Fluorophors am Absorptionsmaximum (lt. folgender Tabelle), CF280 = Korrekturfaktor des Fluorophors (lt. folgender Tabelle).

Fluorophor λmax, nm ε CF280
Sulfo-Cyanin 3 548 162.000 0,06
Sulfo-Cyanin 5 646 271.000 0,04
sulfo-Cyanine 5.5 673 195,000 0.11
sulfo-Cyanine 7 750 240,600 0.04
sulfo-Cyanine 7.5 778 222,000 0.09

Beispielrechnung

Nach der Markierung eines IgG-Antikörpers mit Sulfo-Cyanin 5 und anschließender Aufreinigung wurde das oben abgebildete Absorptionsspektrum aufgenommen. Daraus soll nun das Verhältnis von Farbstoff zu Protein ermittelt werden.

Dem Absorptionsspektrum bzw. obiger Tabelle lassen sich folgende Werte entnehmen: Adye = 0,184 am Absorptionsmaximum des Fluorophors (646 nm lt. Tabelle), AAB = 0,066 (bei 280 nm), εAB = 210.000 für IgG; εDye = 271.000, CF280 = 0,04.

Dye/AB = 2,43 Fluorophormoleküle pro Antikörpermolekül.

Interpretation des Ergebnisses, Antikörperlagerung

In den meisten Fällen wird das optimale Verhältnis von Fluorophor zu Antikörper bei 2–3 liegen. Eine stärkere Beladung mit Farbstoff verbessert das Fluoreszenzsignal aufgrund von konzentrationsabhängigen Quenchingeffekten in der Regel nicht. Sollten bei der Reaktion zu wenige Farbstoffmoleküle konjugiert werden, verringern Sie bitte die eingesetzte Antikörpermenge. Die Verwendung eines abgelaufenen Kits kann ebenfalls zu einem solchen Ergebnis führen.

Es empfiehlt sich, das Bindeverhalten markierter Antikörper an ihr Antigen zu überprüfen. Die markierten Antikörper können bei −20 °C gelagert werden. Ein Gebrauchsaliquot sollte im Kühlschrank gelagert werden, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden. Die Stabilität des Konjugats ist eher von der Stabilität des Antikörpers abhängig als von der des Fluorophors oder der kovalenten Bindung. Die markierten Antikörper sollten nicht über einen längeren Zeitraum dem direkten Sonnenlicht ausgesetzt werden, tolerieren aber üblicherweise das Umgebungslicht.

Sie haben den Artikel in den Warenkorb gelegt.. Warenkorb ansehen oder zur Kasse gehen
Die eingegebene Zahl ist falsch..