Handbuch für das QuDye dsDNA HS Kit

Dieses Kit dient der Konzentrationsbestimmung doppelsträngiger DNA mit dem Qubit™ Fluorometer. QuDye dsDNA HS Reagenz bindet selektiv an doppelsträngige DNA, sodass Nukleotide, einzelsträngige DNA, RNA, Proteine und andere Verunreinigungen keinen Einfluss auf die Messergebnisse haben. Alle Reagenzien sind für die Messungen mit Qubit™ Fluorometer optimiert, der Messbereich für die Ausgangskonzentrationen der DNA-Proben reicht von 10 pg/µl bis 100 ng/µl.

Bestandteile

Komponente Anzahl
12102
100 assays
13102
100 assays (incl. tubes)
52102
500 assays
53102
500 assays (incl. tubes)
33010, QuDye dsDNA HS Reagenz / QuDye dsDNA HS Reagent, 200x, 250 uL 1 1
B9650, Standard / Quantitative standard, 0 ng/ul in TE-Puffer, 1 mL 1 1
B7650, dsDNA-Standard / dsDNA quantitative standard, 10 ng/ul in TE-Puffer, 1 mL 1 1
G2150, TE‑Puffer, 20x, 5 mL 1 1
5555E, QuDye dsDNA HS Assay Kit manual, 1 pcs 1 1 1 1
33115, Polypropylen-Gefäß (dünnwandiges transparentes 0,5 mL), 100 pcs 1 5
63010, QuDye dsDNA HS Reagenz / QuDye dsDNA HS Reagent, 200x, 1.25 mL 1 1
G9650, Standard / Quantitative standard, 0 ng/ul in TE-Puffer, 5 mL 1 1
G7650, dsDNA-Standard / dsDNA quantitative standard, 10 ng/ul in TE-Puffer, 5 mL 1 1
N2150, TE‑Puffer, 20x, 25 mL 1 1

Bei +4 °С lagern. Reagenzien vor Gebrauch auf +20 °C temperieren.

Haltbarkeit: 12 Monate.

! Alle Messungen mit QuDye dsDNA HS Kit werden bei Raumtemperatur (22–28 °С) ausgeführt. Bringen Sie vor Arbeitsbeginn alle Komponente des Kits auf Raumtemperatur. Vermeiden Sie die Erwärmung der Proben, denn die Temperatur der Proben beeinflusst Messergebnisse, insbesondere halten Sie die Röhrchen nicht in den Händen unmittelbar vor den Fluoreszenzmessungen mit Qubit™ Fluorometer.

Verfahren

  1. Setzen Sie 1х ТЕ-Puffer an, wobei für jede Probe und jeden Standard 200 µL 1x TE-Puffer benötigt werden. Den 1х ТЕ-Puffer erhalten Sie, indem Sie 20x TE Konzentrat mit deionisiertem Wasser 20-fach verdünnen.
  2. Setzen Sie QuDye dsDNA HS Farbstoffarbeitslösung an, wobei für jede Probe und jeden Standard 200 µL Farbstoffarbeitslösung benötigt werden. Die Farbstoffarbeitslösung erhalten Sie, indem Sie 200x QuDye dsDNA HS Farbstoffkonzentrat mit 1х ТЕ-Pufferlösung 200-fach verdünnen.
    Zur Messung von 3 Proben und 2 Standards stellen Sie beispielsweise 200 μL x 5 = 1000 μL 1х ТЕ-Puffer und 1000 μL Farbstoffarbeitslösung her (legen Sie 5 μL QuDye dsDNA HS Farbstoffkonzentrat und 995 μL 1x TE-Pufferlösung vor).
    ! Die angesetzte Farbstoffarbeitslösung ist innerhalb von wenigen Stunden aufzubrauchen. Erfolgt die Messung nicht sofort, lagern Sie die angesetzte Farbstoffarbeitslösung lichtgeschützt.
    ! Verwenden Sie zur Herstellung der Farbstoffarbeitslösung ausschließlich Kunststoffgefäße. Ein Glasgefäß kann den Farbstoff adsorbieren, was zur Verringerung der Farbstoffkonzentration in den Proben und Beeinflussung der Messergebnisse führen kann.
  3. Bereiten Sie 2 dünnwandige, optisch durchlässige 0,5-ml-Röhrchen für die Standards und ein Röhrchen je Probe vor. Beschriften Sie die Röhrchendeckel (nicht jedoch die Röhrchenwand, da dies das korrekte Ablesen der Probe stören kann).
  4. Pipettieren Sie in jedes Standardröhrchen 190 µl QuDye dsDNA HS Farbstoffarbeitslösung und 10 µl Quantitative standard, 0 ng/µl (Standard #1) bzw. dsDNA quantitative standard, 10 ng/µl (Standard #2). Vortexen Sie für 2–3 Sekunden und zentrifugieren Sie kurz an.
  5. Pipettieren Sie in jedes Probenröhrchen 180–199 µl QuDye dsDNA HS Farbstoffarbeitslösung und 20–1 µl DNA-Probe (Das Endvolumen muss 200 µL betragen). Vortexen Sie für 2–3 Sekunden und zentrifugieren Sie kurz an.
    Die Verdünnung der DNA-Probe ist optional und hängt von der Ausgangskonzentration ab. Die Ausgangskonzentration der DNA-Proben kann im Bereich von 10 pg/µl bis 100 ng/µl liegen. Die Endmenge der DNA sollte jedoch nach Verdünnung der Ausgangsprobe mit QuDye dsDNA HS Farbstoffarbeitslösung innerhalb des Messbereichs vom Qubit™ Fluorometer liegen, d. h. 0,2–100 ng in 200 µl der zu messenden DNA-Probe. Somit muss die Ausgangsprobe mit einer minimal zulässigen DNA-Ausgangskonzentration von 10 pg/µl 10-fach auf 1 pg/µl verdünnt werden (mischen Sie dafür in einem Probenröhrchen 180 µl der Farbstoffarbeitslösung und 20 µl der Ausgangsprobe mit 10 pg/µl, was 0,2 ng DNA entspricht); die Ausgangsprobe mit einer maximal zulässigen DNA-Ausgangskonzentration von 100 ng/µl muss 200-fach verdünnt werden (mischen Sie dafür in einem Probenröhrchen 199 µl der Farbstoffarbeitslösung mit 1 µl der Ausgangsprobe mit 100 ng/µl, das entspricht 100 ng DNA). Dabei sollten kleine Pipettiervolumina zur Verdünnung der Ausgangsprobe vermieden werden, um die Genauigkeit und Präzision der Messungen zu gewährleisten.
  6. Inkubieren Sie alle Röhrchen (mit Standards und DNA-Proben) für 3–5 Minuten bei Raumtemperatur.
  7. Führen Sie Fluoreszenzmessungen durch.

Fluoreszenzmessung mit Qubit™ Fluorometer

Führen Sie die nachfolgenden Schritte gemäß der Anleitung für das Qubit™ Fluorometer durch. Diese Anleitung bezieht sich auf das Fluorometer Qubit™ 2.0. Je nach Ausführung des Fluorometers können sich Menüpunkte von den unten genannten unterscheiden.

  1. Schalten Sie das Gerät ein und wählen Sie den Menüpunkt DNA, danach dsDNA High Sensitivity.
  2. Das Gerät öffnet automatisch die Registerkarte Standards. Das Fluorometer ist nach jedem Ansetzen einer frischen Farbstoffarbeitslösung neu zu kalibrieren. Sie dürfen aber auch eine zuletzt gespeicherte Kalibrierung benutzen, wenn alle Messbedingungen inklusive der Temperatur im Labor gleich geblieben sind. Drücken Sie in diesem Fall No in der Registerkarte Standards. Das Gerät öffnet jetzt die Registerkarte Sample, in der nun die Fluoreszenzmessung der Proben erfolgen kann. Gehen Sie zum Schritt 3 über.
    Um das Gerät neu zu kalibrieren, drücken Sie in der Registerkarte Standards auf Yes. Setzen Sie das Röhrchen mit dem Standard #1 in den Probenraum ein, schließen Sie den Deckel und drücken Sie Read. Entfernen Sie nach Ablesen der Messwerte (etwa 3 Sekunden) das Röhrchen mit dem Standard #1. Setzen Sie nun das Röhrchen mit dem Standard #2 in den Probenraum ein, schließen Sie den Deckel und drücken Sie Read. Entfernen Sie nach Ablesen der Messwerte das Röhrchen mit dem Standard #2. Nach Abschluss der Kalibrierung öffnet das Gerät die Registerkarte Sample, in der nun die Fluoreszenzmessung der Proben erfolgen kann.
  3. Setzen Sie das Röhrchen mit der DNA-Probe in den Probenraum ein, schließen Sie den Deckel und drücken Sie Read in der geöffneten Registerkarte Sample. Nach Abschluss der Messung wird auf dem Display der QF-Wert angezeigt.
    Der QF-Wert gibt die DNA-Konzentration nach Verdünnung der Ausgangsprobe in einem Probenröhrchen an. Sie können die DNA-Konzentration in der Ausgangsprobe anhand der folgenden Formel berechnen:
    DNA-Ausgangsprobenkonzentration (ng/ml) = QF-Wert x 200/V, wo
    • V (µl) – Volumen der Ausgangsprobe, das ins Probenröhrchen gegeben wurde (1–20 µl),
    • QF - Messwert auf dem Display des Fluorometers (ng/ml).
    Wiederholen Sie den Vorgang für alle zu messenden Proben.
    Sie können die DNA-Ausgangsprobenkonzentration auch über den Rechner am Fluorometer («Dilution Calculator») ausrechnen.

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